斑点叉尾鮰传染性套肠症及其防治

　　1流行情况该病最早发现于2004年3月下旬，在四川省成都市郊的龙泉湖网箱养殖的斑点叉尾鮰发生了一种新型暴发性传染病，该病来势凶猛，具有发病突然，传染快，死亡率高等特点，在出现症状后的1—2d即发生大规模死亡，死亡率一般在90％以上，有的网箱几乎达100％死亡率。我们通过病理剖解和观察发现了一种在鱼类非常罕见的特征性病理变化即“肠套叠”，而且这种肠套叠的出现率很高，可达60％～95％，病鱼一旦出现肠套叠后即不吃食，并很快死亡。相隔一周左右，四川的三台县鲁班湖、中江县继光水库、仁寿县黑龙滩水库和简阳县三岔湖以及大邑、崇州、新津、眉山等县市的网箱和池塘养殖的斑点叉尾鮰相继发生该病。2005年至2006年，该病又连续发生并继续蔓延扩散，不但四川许多养殖斑点叉尾鮰的地区纷纷发生该病，重庆、贵州、云南和湖北等省市也出现该病流行，而且病情更加严重，发病范围进一步扩大，有些地区甚至整池、整箱死亡，以至斑点叉尾鮰养殖遭受毁灭性打击。估计这几年的直接经济损失就在5000万元以上。

　　该病在自然情况下主要感染斑点叉尾鮰，鱼苗、鱼种和成鱼均可感染，其他鲴科鱼类也可感染，但在相同养殖条件下的有鳞鱼未见感染(如鲤鱼、鲫、草鱼、鲢、鳙、鲈和武昌鱼等)。发病季节主要在春夏，3—9月是其发病的时期，但以3～5月高发，一般是每年的3月下旬或4月初开始发病，发病水温多在16℃以上，并随水温的升高病程缩短。发病急，病程短，死亡快，一般发病率在90％以上，病程在2—5d，死亡率90％以上，首次发生的疫区往往为100％。人工感染试验的斑点叉尾纲在接种感染后8h即出现症状，12h后开始发生死亡，在接种后36h内死亡率达100％。

　　2病原该病的病原初步认为是斑点叉尾鲴源的嗜麦芽寡养单胞菌。嗜麦芽寡养单胞菌由Hugh等于1960年发现，该菌属于非发酵型、专性需氧不形成芽孢的革兰氏阴性菌，广泛分布于各种水源、土壤和植物根系等。嗜麦芽寡养单胞菌可使山羊和猪等陆生动物以及一些水生动物感染致病，Ben等(2002)报道嗜麦芽寡养单胞菌是欧洲和美国金枪鱼的一种严重的病原菌，可感染致病引起死亡；同时该菌还可感染鳄鱼、黄缘闭壳龟、卵型鲳和中华绒毛蟹等水产养殖动物而致病。我们于2004年从四川省成都市龙泉湖、三台县鲁班湖、仁寿县黑龙滩水库和简阳县三岔湖等地网箱养殖的斑点叉尾鮰病鱼的体内(肝、肾)分离到一株生理生化特性相同的G—短杆菌(CCFB0024)，通过人工接种试验，复制出与自然病例相同的症状及病理变化，证实其为该病的病原菌。菌株CCFB0024为革兰氏阴性杆菌，极生多鞭毛，无荚膜，无芽孢，鞭毛数≥2(图1，2)。在普通营养琼脂呈灰白色，圆形，表面光滑，边缘整齐的半透明菌落；在TSA平板上形成圆形，表面光滑，边缘整齐，直径0．8—1．2mm的透明的无色菌落；在兔血平板上出现明显的p溶血环。为非发酵型，严格需氧，生长温度范围为15—41℃，最适生长温度为20—30T，在含盐量5％以下的培养基上能生长，生长的pH范围为5．0—9．0，最适pH为6．0—7．0，对除麦芽糖和甘露糖以外的多种糖类不利用产酸，氧化酶阴性，过氧化氢酶、DNA酶、蛋白酶、脲酶、赖氨酸脱羧酶阳性，MR、VP阴性，H：S阴性，冻化牛奶，液化明胶。根据该菌的形态学特征和生理生化特性初步确定为嗜麦芽寡养单胞菌(S．maltophilia)，再结合16SrDNA序列分析进行准确的鉴定，该菌的16SrDNA序列与16SrDNA的同源性最高，且在系统发育树上与其他的嗜麦芽寡养单胞菌菌株聚在一簇，其同源性在99．4％—99．6％之间，从而在分子生物学水平确切鉴定该菌为嗜麦芽寡养单胞菌。

　　该菌胞外产物具有溶血活性、Vero细胞毒性、肠毒性、蛋白酶活性、脂酶活性、DNA酶活性和动物致死性，其对小白鼠的LDs0为4．70mg／ks，对斑点叉尾鮰的LDso为3．21mg／kg。该菌胞外产物接种健康斑点叉尾鲴后，也出现体表的褪色斑、腹水、肠炎、肠套叠和肝、脾、肾肿大等病变，这与该活菌感染发病的病变相似，表明嗜麦芽寡养单胞菌胞外产物在其致病机制中有着重要的作用。该菌的外毒素是一种相对分子质量为2076D的多肽，该毒素对多种动物红细胞具有溶血活性，能使兔回肠结扎产生积液反应，致Vero细胞形态学改变，表明其具有溶血活性、肠毒性和细胞毒性，对Vero细胞的CDso为0.126ug。该外毒素对斑点叉尾鲴具有明显的致病性，LDso为1．85ms／kg，接种鱼出现与嗜麦芽寡养单胞菌感染的相似症状与病变，全身多种组织和器官都具有明显的损伤，病鱼RBC和Hb含量显著减少，WBC增加，红细胞脆性增加，血清AST、ALT、LDH、CPK活性显著升高，血清Cr、BUN含量明显升高，血糖浓度降低和IgM含量降低。

　　3症状自然发病初期病鱼表现为游动缓慢，靠边或离群独游，食欲减退或丧失，并很快发展为各鳍条边缘发白，鳍条基部、下颌及腹部充血，出血。随病程的发展病鱼腹部膨大，体表出现大小不等色素减退的圆形或椭圆形的褪色斑(图3)，大的退色斑块直径3cm，以后在退色斑的基础上发生溃疡。小的溃疡灶直径0．3～0．5mm，大的溃疡灶直径达3sm，并很快着生水霉；部分鱼垂死时出现头向上，尾向下，垂直悬挂于水体中的特殊姿势，最后病鱼沉入水底死亡，当提拉网箱检查时才发现箱底沉有大量的死鱼。发病率90％左右，死亡率80％以上。人工感染试验的斑点叉尾鮰在接种感染后8h出现游动无力，呼吸缓慢，并逐步出现头向上，尾向下悬垂于水体中的特殊姿势，12h后开始发生死亡，在接种后36h内死亡率达100％。

　　4病理变化病鱼主要表现为体表(特别是腹部和下颌)充血、出血和褪色斑，肛门红肿，外突，有的鱼甚至出现脱肛现象，后肠段的一部分脱出到肛门外(图4)。鳃丝肿胀发白，粘附大量粘液。腹部膨大，腹腔内充满大量清亮或淡黄色或含血的腹水(图5)，胃肠道粘膜充血、出血，胃肠道内没有食物，胃底部和幽门部粘膜充血、出血。肠道发生卡他性出血性肠炎，肠壁充血，出血，变薄，肠腔内充满淡黄色或含血的粘液(图6)，肠道发生痉挛或异常蠕动，常于后肠出现1—2个肠套叠，套叠的长度为0．5—2．5cia(图7、8)，发生套叠和脱肛的肠道明显充血、出血和坏死，部分鱼还见前肠回缩进入胃内的现象。肝肿大，颜色变淡发白或呈土黄色，部分鱼可见出血斑，质地变脆(图9)，胆囊扩张，胆汁充盈；脾、肾肿大，淤血，呈紫黑色，部分病鱼可见鳔和脂肪充血和出血。

　　病理学组织上，全身多组织器官水肿，细胞肿胀、变性、坏死和炎症细胞浸润，特别是肝、肾、胃肠道和骨骼肌的损伤较为严重，为其损伤的靶器官。鳃小片水肿，呼吸上皮与毛细血管分离，上皮细胞肿胀、变性、脱落，充滞于鳃小片间隙内及鳃丝间，同时有多量中性白细胞浸润(图10)。心肌纤维颗粒变性，肌间隙增宽，血管扩张充血、出血，巨噬细胞、中性白细胞浸润。肝水肿，狄氏间隙增宽，肝细胞肿胀，空泡变性，甚至发生溶解坏死(图11)，胰腺细胞变性、坏死，炎症细胞浸润(图12)。肾脏表现为急性肾小球肾炎，肾小球肿大，肾小囊内有多少不等的红染的炎性渗出液和炎症细胞，肾小管和集合管广泛性地变性、坏死；肾间质水肿，造血组织坏死，拟淋巴组织减少，炎症细胞浸润。胃肠道表现为卡他性—出血性—坏死性胃肠炎，胃粘膜上皮变性、坏死，脱落，固有膜裸露，固有膜毛细血管扩张充血，大量中性白细胞、巨噬细胞浸润。低倍镜下可见肠道肠管环的套叠现象(图13)，肠上皮变性、坏死，脱落，脱落的上皮细胞、单核细胞和粘液及大量中性白细胞和红细胞充斥于肠腔内，病变严重的病例可见固有膜、粘膜下层坏死，甚至整个肠壁都发生坏死。脾被膜水肿，中性白细胞和巨噬细胞浸润；脾髓内大量含铁血黄素沉积，红髓淤血，脾窦内充满大量红细胞、巨噬细胞和一定量的中性白细胞。脑水肿，脑膜血管扩张，充血，脑基质水肿，疏松多孔，呈海绵状，神经细胞肿胀，体积增大，胞核淡染，靠边，有的发生固缩。骨骼肌纤维肿胀变性，横纹模糊，消失，肌浆发生不均匀溶解，严重者肌细胞发生坏死，断裂，崩解，肌间隙有巨噬细胞和中性白细胞浸润(图14)。

　　超微病理学上，病鱼肝肾脾肠等器官的细胞均有较为严重的损伤，细胞肿胀，超微结构破坏，特别是线粒体和细胞核的损伤很明显。线粒体表现为肿胀，嵴断裂，断裂或溶解消失，呈空囊状；细胞核变形、染色质溶解或发生浓缩、裂解边移，甚至形成类似凋亡小体的结构。

　　5诊断对斑点叉尾鮰传染性套肠症的确诊需从病变组织内分离到嗜麦芽寡养单胞菌，并结合临诊症状和病理变化进行综合诊断。用16SrDNA序列分析鉴定嗜麦芽寡养单胞菌更具有准确性，16SrRNA是核糖体RNA的一种，所含的遗传信息丰富，在结构上分为保守区(Conserveddomain)和可变区(Var·iabledomain)，保守区能反映生物物种的亲缘关系，可变区则能揭示生物物种的特征核酸序列，被认为是最适于细菌系统发育和分类鉴定的指标。目前，16SrRNA或16SrDNA序列分析已广泛用于水产动物病原菌的鉴定。研究快速准确的诊断方法有助于早诊断，早治疗，用病鱼肾的组织或其他脏器组织的涂片进行荧光抗体技术或通过血清学酶联免疫吸附试验(ELISA)可进行快速诊断。

　　6防治(1)由于该病具有发病突然，传染快，流行广，死亡率高，一旦发病后很难控制等特点，因此对该病的防治应根据发病特点及病原的特性有针对性地采取防控措施。加强饲养管理，改善水体环境条件，科学饲喂，尤其是水质、气候突变的时候要注意防病，尽量减少低溶氧和恶劣的水环境等应激因子的刺激。由于本病在开春后，一般是每年的3月下旬或4月初开始发病，发病水温多在16℃以上，因此要及早预防，在饲料中添加病原菌敏感的药物投喂，预防该病的发生。当发生该病时，应尽早诊断，尽早治疗。

　　(2)免疫预防是本病最有效最关键的预防措施。因此研制出有效的免疫疫苗将对该病的预防控制起着重要作用。但目前对嗜麦芽寡养单胞菌感染免疫预防的资料还很少，我们对斑点叉尾鲴源嗜麦芽寡养单胞菌进行了初步的疫苗防制，以强毒株制成全菌体的灭活疫苗，采用腹腔注射、浸泡和口服法对健康斑点叉尾鲴进行免疫接种，其中浸泡和口服法分别进行了加强免疫，实验鱼对嗜麦芽寡养单胞菌的血清凝集抗体效价及其对嗜麦芽寡养单胞菌的抵抗力均显著提高，使用过本疫苗的鱼均获得了较高的保护率。

　　(3)外用消毒药。主要采用一些消毒泼洒剂进行水体消毒，杀死水环境中的病原菌，但斑点叉尾鲴为无鳞鱼，应选择刺激性小的药物，如二氧化氯、二氯海因、溴氯海因等。

　　(4)内服药物。本病造成的经济损失大小与药物使用的早迟有关，如果怀疑为本病发生时，应尽快做病原菌的分离鉴定和药敏试验，根据药敏试验结果合理选用抗菌药物。因为嗜麦芽寡养单胞菌具有多重耐药性，对多数常用的抗菌药物都有抗性，且对一些开始敏感的药物也很快会产生耐药性，这给该菌感染的治疗带来很大的困难，因此在该菌感染的治疗中根据药敏试验结果，合理选用抗菌药物是决定药物防治该病成败的关键。研究发现该菌对广谱青霉素和大部分头孢菌素耐药性高，对氨曲南耐药率97％，氨苄西林94％，对头孢唑林、头孢克洛、头孢呋肟、头孢噻肟、头孢西丁、头孢曲松的耐药率均>90％；对氨基糖苷类药物阿米卡星和庆大霉素耐药率约64％，妥布霉素77％，且对其它氨基糖苷类耐药率也较高，甚至达100％。有研究表明，替卡西林／克拉维酸与复方新诺明的联合用药具有良好的体外协同作用，用复方新诺明和替卡西林／克拉维酸联合应用来治疗嗜麦芽寡养单胞菌心内膜炎，取得了满意的效果。根据我们的药敏实验结果，斑点叉尾鲴源嗜麦芽寡养单胞菌对磺胺噁唑、磺胺甲噁唑、阿齐霉素、洛美沙星、氯霉素、强力霉素类等高度敏感；对四环素、多粘菌素、诺氟沙星等中度敏感；对妥布霉素、庆大霉素和丁胺卡那霉素等低度敏感；对青霉素、链霉素、麦迪霉素、新霉素、万古霉素、头孢克洛、头孢三嗪、头孢唑啉、头孢噻肟、头孢西丁、先锋霉素V等具有耐药性。我们通过临床使用效果证实，复方新诺明、洛美沙星、丁胺卡那、氧氟沙星和强力霉素等都是对病原菌很敏感的药物，若及时使用，一般在1—2个疗程即可控制该病。